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常見問題
  • 為什么使用基因特異性引物(GSP)?

    GSP在擴增低豐度的轉錄本時是最好的。OligodT引物建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄;隨機引物用于mRNA片段的逆轉錄。

  • 無反轉錄酶的情況下,對照RNA獲得擴增結果

    通常是由于對照RNA中含有痕量DNA而導致的。由于進行體外轉錄時不可能將所有的DNA模板消除建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。 有可能是引物二聚體的條帶

  • 產生大分子量的彌散條帶

    大多數情況下是由于退火溫度過低而導致的非特異性的起始及延伸產生的 對于長片段的PCR,建議將反應體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)

  • 產生彌散(smear)條帶

    在PCR反應體系中第一鏈產物的含量過高 減少引物的用量 優化PCR反應條件/減少PCR的循環次數 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時,其產生的寡核苷酸片段會產生非特異性擴增,一般會顯示為彌散背景。

  • 產生非特異性條帶

    用RT陰性對照檢測是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對照的PCR結果也顯示同樣條帶,則需要用DNase I重新處理樣品。 在PCR反應中,非特異的起始擴增將導致產生非特異性結果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進行退火,降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結果的產生。 由于mRNA剪切方式的不同,根據選擇引物的不同將導致產生不同的RT-PCR結果。

  • 擴增產物在電泳分析時沒有條帶或條帶很淺

    最常見的原因在于您的反應體系是PCR的反應體系而不是RT-PCR的反應體系 與反應起始時RNA的總量及純度有關 建議在試驗中加入對照RNA 第一鏈的反應產物在進行PCR擴增時,在總的反應體系中的含量不要超過1/10 建議用Oligo(dT)或隨機引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級結構,如環狀結果,有可能導致GSP無法與模板退火;或SSⅡ反轉錄酶無法從此引物進行有效延伸。 目的mRNA中含有強的轉錄中止位點,可以試用以下方法解決:  a. 將第一鏈的反應溫度提高至50℃。  b. 使用隨機六聚體代替Oligo(dT)進行第一鏈反應。

  • human u6 promoter 表達框,是如何設計的?

    human U6 promoter表達框包括human U6 promoter、終止碼TTTTT和中間自行設計的抑制序列或抑制序列的發卡結構。從人基因組中可以擴增出U6 promoter,后面的序列全部自己設計。

  • 為什么RNAi表達載體的克隆有時無法測序?

    可能原因是stem的長度剛好和primer相當,所以primer退火時hairpin結構也形成,從而影響測序。分析一下發現它與stem的長度及序列有關。冷泉港推薦改變sense strand上幾個堿基,使其在DNA水平不互補,但RNA卻能利用G-U互補形成hairpin。

  • 如何使用Pol III啟動子制備RNAi表達載體

    目前發表的RNAi表達載體大多采用3型Pol III啟動子,如human/mouse U6啟動子等。其中人U6啟動子有幾個明顯的特點:1.具有TATA box,位于-30~-25bp,被Pol III轉錄;2.在轉錄起點上游-66~47bp處存在PSE(proximal sequence element),該元件是snRNA激活因子蛋白復合物的結合位點;3.在-244~-214存在DSE(distal sequence element);4.啟動子下游存在5'-TTTT-3'序列為Pol III提供轉錄終止信號;5.PSE和DSE之間的距離變化可顯著影響轉錄效率;6.+1位的G對轉錄效率影響較大。根據這些特點,在使用U6啟動子構建RNAi表達載體時,U6啟動子的長度最好在300bp左右,盡量不改變PSE和DSE的間距,同時保留TATA box和+1位的G,在下游應有5'-T噑TTT-3'序列作為終止信號。另外可以根據需要在啟動子上游或終止信號下游設計測序引物序列、酶切位點等等。  如有興趣可以利用同尾酶設計poly-RNAi表達載體,從而可以觀察同時knockdown兩個或多個基因表達后產生的效應。若是條件允許,可以對U6啟動子進行shuffling,篩選具有特殊用途的突變的Pol III啟動子。

  • 一般設計多少bp的siRNA,以及轉錄的終止子?

    因為人工合成siRNA價格太高,現在經常采用RNAi expression vector,抑制序列一般在19-22bp。使用Pol III啟動子時轉錄終止碼為5'-TTTTT-3',而使用Pol II啟動子則為polyA。其實這兩種終止碼都不能完全避免通讀(readthrough)現象的發生。現在RNAi多用前者,是因為其較短,不形成復雜的空間結構;后者因為較長,形成的空間結構可能會對抑制序列發卡結構的形成構成空間阻礙或產生遮擋效應。

  • 是否可以插入到真核表達質粒載體中?

    可以,這些載體都是真核表達載體,根據國外的經驗,質粒載體的knockdown作用一般僅持續一周左右,一周后被down的RNA水平即恢復原有水平,其機制尚未闡明。推薦使用逆轉錄病毒載體達到穩定轉染的效果。

  • H1啟動子和U6啟動子有什么差別?

    上海吉瑪的supersilencing shRNA 載體分別使用Pol III依賴H1或者U6的啟動子。盡管H1和U6是polⅢ 型啟動子,然而可能根據使用細胞系的不同,效率有些小的差別。

  • 為什么使用pol III型啟動子?

    使用pol III型啟動子是為了有效表達shRNA。這些pol III型啟動子包含了表達RNA上游所有的必要的元件,而且在一個短的多聚胸苷區內終止。一旦shRNA被表達,它被轉移出細胞核,在細胞質中被Dicer加工成siRNA。Dicer優先識別由 pol III型啟動子產生的shRNA,因為它們不帶有5’或者3’兩側連接的序列。siRNA進入RISC復合體中,在哺乳動物細胞中產生RNAi效應。

  • 為什么使用載體導入shRNA?

    在哺乳動物細胞中,RNAi可以通過直接導入特異阻斷所選擇基因表達的分子而誘導,導致產生基因功能缺失表型。這些分子可以通過化學合成、體外方法制備或者細胞內DNA模板產生。前兩種方法只能用于瞬時阻斷,可能很難導入難以轉染的、不分裂的或者原代細胞類型。通過載體導入pol III 啟動子表達的短的發夾RNA(shRNA)擴展了RNAi實驗的選擇,包括穩定和可誘導表達以及病毒導入。

  • 沉默效果不理想,應該如何處理?

    最常見的影響沉默效果的兩個原因是:轉染效率低和siRNA序列設計的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的細胞系,并發現沉默效果不佳,我們建議您對轉染效率進行檢測,并選擇優化轉染條件。如果您已經對實驗轉染條件進行優化但是問題依然存在,我們建議您換用另一種轉染試劑或是采用其他技術,這也許能提高轉染效率。如果已經提高了轉染效率但是沉默效果仍然未達到要求,可能是因為siRNA序列設計的效果不理想。

  • 小鼠體內實驗需要多少siRNA?

    迄今為止還沒有明確的siRNA體內實驗使用量的計算方式,在實驗前最好先從文獻中查詢是否已經有相關的文章發表。對于常規實驗,一般使用100 μL的注射體積,濃度為10 to 500 μM。原先用antisense的研究表明,當劑量大于20 mg/kg/day (416 mM)時,會觀察到明顯的毒性。最好針對您的實驗繪制劑量反應曲線。 常規情況下,給藥劑量可以以 ~5mg/kg/day [~7.7 nmol/day or 100 mM per day]作為優化起點。需要注意的是,這個劑量只是一個預實驗的起點,最后的給藥劑量取決于動物模型、靶基因、靶組織和給藥方式等因素

  • 上海吉瑪合成的siRNA是否可以用于動物水平的實驗?

    上海吉瑪 的siRNA經過嚴格HPLC純化,已經被用戶通過局部注射用于小鼠的體內實驗,并且得到滿意的實驗結果。

  • 在體內研究中,最好的給藥途徑是什么?給藥頻率是多少?

    寡核苷酸可以通過大劑量給藥或使用ALZET微小泵持續給藥。大劑量給藥時要慎重,因為已有研究表明:一些毒性與寡核苷酸反義鏈的濃度有關,快速給藥時可能會導致動物下肢癱瘓或致死,所以給藥時要注意觀察。很多已發表的論文實驗是通過尾靜脈給藥的。任何給藥方式都需要優化,以確保最佳的導入方式和動物的健康。一般拿靜脈注射來說,每天注射一到兩次,連續注射一到兩周。

  • 開始體內實驗前需要注意什么問題?

    體內實驗設計包含動物模型的選擇、給藥途徑、劑量和給藥次數等等。siRNA使用的數量及濃度主要取決于給藥靶點的性質,諸如腫瘤的類型,組織的類型,靶基因表達水平,動物模型個體大小等等,針對不同的研究模型,最好先查閱相關資料。

  • 我計劃使用RT-PCR檢測基因knockdown結果,之前應該注意哪些問題?

    我們推薦RT-PCR的引物應該設計在target位置的兩側,而不是同側。目前已經知道的siRNA介導的基因knockdown機制是RSIC先介導靶mRNA的切割,切割導致靶mRNA的降解,由于切割和降解可能具有不同的時間點,因此,設計于同側的PCR引物可能導致假陰性結果或knockdown效率的低估。  另外,RT-PCR結果會因為靶基因mRNA降解時間不同、細胞內靶基因mRNA豐度不同而導致假陰性結果,特別對于豐度較高的基因,推薦使用的檢測方式包括定量PCR、Northern檢測、western檢測等。這些方法會更加真實的反映RNAi的結果。

  • 反義核酸和RNAi有何差異?

    反義核酸和RNAi從作用原理到使用的范圍都有很大差異。這里只能做一個簡單的介紹:從原理上說,反義核酸是一段與靶基因配對的單鏈DNA或類似DNA的片段與靶基因結合,結果阻止靶基因的轉錄或是翻譯,以往的研究表明在反義核酸的研究中,序列的有效性和有效序列的非特異性往往有比較高的正相關性,這就在一定程度上限制了反義核酸的應用。  RNAi的作用機理是雙鏈的RNA進入細胞內,導致靶基因的切割和降解。siRNA的序列可以選擇在高度特異針對靶基因的位置,也就為RNAi作為藥物研究提供了高效、低副作用的空間。自從RNAi技術問世以來,國外很多專業從事反義核酸研究的公司都紛紛轉向RNAi研究, ISIS是一個非常就有代表性的例子。他們認為,如果使用反義核酸可以進行的研究,以及反義核酸可以涉及的研究領域,RNAi均可以毫不示弱的開展,并且應該會得到更加令人滿意的結果。  我使用合成的雙鏈DNA克隆載體,但是測序結果不正確,是DNA合成的問題,還是其他問題?  首先,質量良好的、并且是退火狀態良好的dsDNA是克隆成功的關鍵因素。一般情況下,需要挑不止一個克隆測序(通常是2個以上),如果兩個克隆的序列都是錯誤的,并且錯誤的堿基是相同的,那么基本可以確定是DNA oligo合成的問題. 如果兩個克隆的不同堿基發生錯誤,有可能是合成片段本身的問題,也有可能是克隆過程造成的問題,可以再多挑1~2個克隆測序確證。大多數情況下,兩個陽性克隆中,一般至少會有一個克隆是正確的,這種個別堿基在個別分子中的錯誤是合成和克隆過程共同造成的,但一般發生的幾率較低。

  • 我的課題主要是研究細胞凋亡相關基因,我手上有一些新基因需要使用RNA干擾進行深入研究,我該如何選擇對照系統?

    用RNAi進行pathway研究,是RNAi主要應用之一。在這樣的課題中,對照系統的選擇尤其重要。已經發表的和已經驗證的siRNA為RNA干擾研究提供了系統性對照。用RNAi進行細胞凋亡相關基因的研究,以往已經有眾多的文獻報道,可以查閱上海吉瑪網站www.ddshk.com.cn。

  • 如何將siRNA導入到細胞內?

    使用什么樣的轉染方法,很大程度上取決于您使用的細胞系:   1.貼壁的、易轉染的細胞,我們推薦使用RNAi-mate;  2.懸浮的或原代的細胞,我們推薦使用電擊轉化方法;  3.電擊轉化效率仍然很低的細胞,需要選擇載體系統。 上海吉瑪除提供化學合成的siRNA以外,還提供完整的載體系統,請參閱產品資料。

  • 轉染過程中發現大量細胞死亡,我應該如何處理?

    如果出現細胞大量死亡,意味著您的轉染條件仍然需要優化:  轉染條件的優化一般包括以下幾個方面:  1. 調整轉染試劑的濃度;  2. 在轉染后適當的時間內更換無轉染試劑的培養液,  3.調整細胞的生長狀態;一般處于良好生長狀態的細胞對轉染試劑就有更好的耐受性; 4.調整轉染試劑和siRNA的比例; 如果同一管轉染試劑在不同實驗中對細胞的毒性有差異,一般說來應該是實驗過程本身帶來的差異;  如果已經做了以上幾項工作,轉染效率仍然得不到提高,建議您更換一種轉染試劑。

  • 如何篩選轉染試劑?

    好的轉染試劑有以下特點:1、對siRNA有較高的轉染率;2、對細胞的毒性小。在mRNA水平檢測siRNA導入的效果比用看家基因的siRNA陽性對照檢測更為準確。

  • 熒光素的最大吸收率和發射率各在哪個波段?

    熒光素在495nm處有最大吸收率,在520nm處有最大發射率。

  • 熒光標記的siRNA是不是可以作為良好的對照?如何檢測熒光標記的siRNA?

    已經有為數不少的實驗室研究過熒光標記的siRNA的熒光檢測結果和knockdown效率之間的正相關關系。熒光標記雙鏈是最常用的優化轉染條件的方法。可以用流式細胞儀或者熒光共聚焦顯微鏡檢測標記的siRNA。

  • 定量RNA的公式是什么?

    研究者可以用Beer法則定量RNA:吸光度(260nm)=(摩爾消光系數)*(濃度)*(路徑長度,cm)。為了便于理解,等式變為:濃度=(吸光度,260nm)/[(摩爾消光系數)*(路徑長度,cm)]。當使用一個標準的10mm比色皿時,在公式中路徑長度這個變量等于1。 6uL濃度為10uM的siRNA溶解液中含有多少ug的siRNA? 首先計算含有多少nmol的siRNA: a. 等式: nmol = (6 uL)(10 umol/L);b. 單位換算: nmol = (6 uL)(10 umol/L)(1 L/1,000,000 uL)(1,000 nmol/umol);c. 答案: nmol = 0.06 nmol。然后利用siRNA的平均分子量(13,300 g/mol)把nmol變為ug:a. 等式: ug = (0.06 nmol)(13,300 g/mol);b. 單位換算: ug = (0.06nmol)(13,300 g/mol)(1mol/1,000,000,000 nmol)(1,000,000ug/g);c. 答案: ? ug = 0.798≈0.8 ug。所以6uL濃度為10uM的siRNA溶解液中含有0.8ug的siRNA。 我需要濃度為20uM的樣品,如何計算重懸siRNA緩沖液的量? 樣品濃度的計算如下:(siRNA的量,nmol)/(重懸體積,uL)=樣品濃度,umol/L。在解答前應先統一單位,確保單位可以抵消。例如:您購買了20nmol的siRNA,想溶解為50uM的樣品。可按以下方法計算重懸緩沖液體積:a. 等式: (20 nmol)/ uL = 50 umol/L;b. 解答未知量: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol);c. 單位換算: uL = (20 nmol)(1 L/50 umol)(1 umol/1,000 nmol)(1,000,000 uL/1 L);d.答案: uL = 400 uL。因此,應該使用400uL緩沖液去重懸20nmol的siRNA,溶解后為50uM的樣品。 一定需要陰性對照嗎? 是,陰性對照是RNA干擾實驗中不可缺少的。由于在超過200 nM的濃度下,siRNA有可能會導致非特異性的壓力反應,在實驗體系中必需設置陰性對照。它能夠幫助我們確認基因表達水平的降低是否是序列特異性的RNAi的結果。由于siRNA的合成方法和工藝以及轉染試劑等因素可能導致廣泛的基因沉默現象。如果沒有陰性對照,研究人員很可能錯誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當作由RNAi引起的基因特異性沉默。 常用的陰性對照有哪些類型? 常用的陰性對照大體分為兩種,一種是使用通用陰性對照序列,該序列已經被上千篇文章使用;另一類是使用和靶基因siRNA打亂序列的siRNA作為陰性對照,這樣的陰性對照和通用序列相比較,一方面合是按照定制產品價格合成的,另一方面,由于打亂序列是沒有經過驗證的序列,有可能會產生off-target現象。因此,除非有非常特殊的要求,最好使用通用序列作為陰性對照。 在陰性對照體系中和實驗體系中觀察到同樣的實驗結果,這是什么原因? 這個結果充分說明了設置陰性對照的必要性。該結果表明您所觀察到的表型不是序列特異性knockdown產生的表型,您需要降低siRNA的工作濃度。 為什么說陽性對照在RNA干擾實驗中很重要? 陽性對照作為一個實驗系統檢查是很重要的。也就是說,當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時,您能確保在您的實驗方法中您的轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。通常最好的陽性對照是內在的對照 你們能提供預先合成的siRNA對照么? 可以。吉瑪能提供許多預先合成的用于RNA干擾實驗的對照雙鏈。 用于對照的siRNA的最佳濃度是多少? 陽性對照和陰性對照的siRNA的濃度都應該與基因特異性的siRNA的濃度相同。 不同工作濃度下1OD siRNA可以使用多少次 工作濃度 1 OD siRNA可以使用孔數(孔) 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 100mm dish 5nM 5000 2500

  • 用100nM 的siRNA轉染時只得到50%沉默效率,我可以把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎?

    增加siRNA的濃度一般不能改進沉默效率。高濃度的siRNA將可能導致去靶作用和對細胞的毒性。siRNA的高基因沉默效率來自于合理的設計,在100nM 甚至更低的濃度都可能有75%的沉默效率。另外,低的轉染效率會導致低的沉默效率,建議您更進一步優化siRNA的導入條件。

  • 在體外實驗中,需要多少量的siRNA?

    我們建議您用于實驗的siRNA的濃度為100nM。1nmol siRNA的量對于一個24孔板或是96孔板的實驗已經足夠了。

  • 你們提供的siRNA是怎樣裝運的?如果在常溫下放置了一個星期,還有效嗎??

    吉瑪公司為您提供的siRNA是凍干粉包裝的,在常溫下運輸。這些凍干的樣品在室溫下能穩定保存2-4個星期,所以放置一個星期不會影響其沉默效果。但我們建議您收到樣品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷凍箱中。

  • 如何選擇siRNA的懸垂組成?

    懸垂的序列組成是由顧客自行選擇的。最近研究表明懸垂的組成在mRNA靶識別和酶解中不是很重要。懸垂可能在形成RISC的過程中起結構的作用。很多研究人員選擇dTdT是因為研究表明脫氧核糖核苷能保護siRNA免受酶解。合成序列最重要的是確定靶mRNA的19個堿基的核心結構。

  • 我們需要提供什么信息用于siRNA的合成?你們可以幫助免費設計嗎?

    您需要準確地提供siRNA的19個核苷酸的靶序列和懸垂的合成物,或者您也可以提供相應地基因的GeneID或者Accession Number,由我們公司技術人員為您免費設計。

  • 合成RNA寡核苷酸的最大長度是多少?

    目前RNA寡核苷酸的最大長度是50堿基。

  • 吉瑪公司提供的siRNA是雙鏈的還是單鏈的?

    吉瑪公司的siRNA是雙鏈的,而且也是按照雙鏈來定價的。

  • 針對人體基因設計的siRNA對其他物種是否也有效?

    一般siRNA都具有物種特異性,很少與其他物種有相同的靶位點,所以針對人體基因設計的siRNA不會沉默其他物種的同源序列。然而,也有研究表明siRNA經過特異性設計后能對兩個或兩個以上的物種有效,這需要仔細進行siRNA設計和生物信息學分析。對兩個或兩個以上的物種有效,這需要仔細進行siRNA設計和生物信息學分析。

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